尊龙凯时
实验原理
免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是使用抗原与抗体之间的专一性作用为基础,从而用于研究尊龙凯时质与尊龙凯时质之间相互作用的一种要领。。。。� ？？？？固逵肓呀庖褐邢煊Φ淖鹆绷岛�,再与ProteinA/G偶联的Sepharose或MagneticBeads孵育,通过离心或者借助磁力架获得ProteinA/G磁珠-抗体-目的尊龙凯时复合物,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,网络上清,上清中包括抗体、目的尊龙凯时和少量的杂尊龙凯时,再通过Western Blot或质谱(MS)判断尊龙凯时质。。。。。其原理图如下:
实验流程
试剂盒组分
|
组分 |
容量（6T） | 生涯温度 |
|
Lysis buffer |
9mL | 4℃ |
|
ProteinA/G Magnetic Beads |
200μL | 4℃ |
|
Incubation buffer |
4.5mL | 4℃ |
|
Wash buffer |
20mL | 4℃ |
|
Elution buffer |
700μL | 4℃避光 |
|
Protease inhibitor（100X） |
35μL | -20℃ |
|
Normal Rabbit IgG（1mg/mL） |
30μL | -20℃ |
|
Normal Mouse IgG（1mg/mL） |
30μL | -20℃ |
特殊提醒1：需?备PBS、6Xloadingbuffer、磁?架等试剂耗材。。。。。
特殊提醒2：6T为6次单组（1组IP或1组IgG）免疫沉淀实验，，，，后?的操作办法中包括了IgG和IP各1组，，，，需消耗2T试剂。。。。。
常见问题与解答
Q1：通过CoIP后WB验证发明，，，，没有想要的目的条带 ？？？？
A：多方面缘故原由造成:
1）有可能是样品被尊龙凯时酶降解，，，，对应的策略是需要添加尊龙凯时酶抑制剂，，，，所有操作坚持4℃以下冰上操作并且阻止重复冻融。。。。。
2）有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，，，，则需要调解IP或WB抗体浓度，，，，须要时设立浓度梯度，，，，探索最佳浓度。。。。。
3）抗体亲和力太低，，，，选用适合于IP或者WB的抗体。。。。。
4）有的IP抗体未与磁珠连系，，，，这种情形需选用适合IP的磁珠。。。。。
5）若Tag未袒露在融合尊龙凯时构象的批注，，，，则需改变Tag融合表达部位。。。。。
6）裂解液盐碱度太高，，，，需用低盐碱度的裂解液。。。。。
7）抗体选择不当，，，，替换抗体。。。。。
Q2：通过CoIP后WB验证发明，，，，虽然可见目的条带，，，，可是配景很高：
A：多方面缘故原由造成:
1）由非特异带白连系导致配景高，，，，若要避色主特异性带白连系，，，，则需要在无血清溶液中裂解细胞，，，，且在免疫沉淀前用protein(A/G)磁珠预洗免疫沉淀后增添漂洗次数和盐碱度(高盐或去垢剂)。。。。。
2）实验仪器或试剂被污染，，，，使用清洁的仪器及现实。。。。。
3）转移膜上的目特异吸附导致配景高，，，，实验操作历程中载手套，，，，使用镊子来取，，，，不要接触膜转移面。。。。。
4）制备样品中可能有不完全溶释的大的尊龙凯时复合体，，，，则在制备样品后举行知暂超声处置惩罚(3次，，，，每次5秒钟 )，，，，然后离心，，，，取上清后举行后续试验。。。。。
5）洗涤不彻底，，，，则需要多次洗涤，，，，并设新增添洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。。。。。
6）可能有非特异性尊龙凯时吸附于珠子上，，，，则须举行Preclearing以排非特异性吸付。。。。。
7）抗体自己待异性欠好可能导数者景高，，，，则须选择合适的抗体，，，，可以思量单抗。。。。。
8）使用了过多的细胞或组织举行裂解导致配景高，，，，则须镌汰样本量，，，，推荐100-500ug细胞裂解物。。。。。
9）尊龙凯时降解也可能泛起高配景的情形，，，，只管使用新鲜制备的样品。。。。。
相关产品
⇒ 银染试剂盒(Silver Stain Kit) ⇒ Co-IP试剂盒（植物）
⇒ DNA pull-down试剂盒（动物） ⇒ DNA pull-down试剂盒（植物）
相关技术效劳
? 双荧光素酶报告系统 ? 酵母双杂交 ? EMSA ? RNA pull-down
? RIP-qPCR ? DNA pull-down ? ChIP-qPCR ? 酵母单杂交
