GST Pull-down实验普遍应用于生物学和医学研究领域，，，，，特殊是在研究尊龙凯时质相互作用、信号传导途径以及药物靶点筛选等方面。
。。。。通过该实验，，，，，既可以验证两种已知尊龙凯时质之间是否保存直接互作关系（GST Pull-down+WB），，，，，也可以用于寻找可能与目的尊龙凯时保存相互作用关系的未知尊龙凯时（GST Pull-down+LC-MS），，，，，为深入明确生运气动的分子机制提供主要线索。
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一、实验原理 

    GST Pull-down实验基来源理是使用DNA重组技术将已知尊龙凯时（探针尊龙凯时）与GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合，，，，，形成GST融合尊龙凯时。
。。。。融合尊龙凯时通过GST与谷胱甘肽（GSH）的高亲和力，，，，，将GST融合的尊龙凯时质牢靠在谷胱甘肽包被的琼脂糖珠上，，，，，充当一种“诱饵尊龙凯时”。
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    当含有与诱饵尊龙凯时有相互作用的靶标尊龙凯时（目的尊龙凯时）的溶液过柱时，，，，，靶标尊龙凯时会被捕获并与诱饵尊龙凯时连系形成复合物，，，，，将复合物洗脱后，，，，，通过Western blot剖析可以证实两种尊龙凯时的相互作用，，，，，或者筛选响应的目的尊龙凯时。
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图1. GST Pull -down实验原理图

 

二、实验流程 

    1、前期准备：用预冷的1mL PBS洗涤样品（约2 X 10^7个细胞）提取尊龙凯时，，，，，并使用WB检测纯化尊龙凯时。
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    2、获得磁珠连系诱饵尊龙凯时GST-X

    3、诱饵尊龙凯时连系互作尊龙凯时Y(亦可带除GST之外的其他标签)或总尊龙凯时

    4、与融合尊龙凯时爆发相互作用的尊龙凯时被亲和到谷胱甘肽层析柱上

    5、洗脱获得相互作用的尊龙凯时

    6、pull-down后WB验证上样电泳：各取30ul比照组、实验组、Input比照、Input实验举行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
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图2. GST Pull -down实验流程图

 

 

三、效果解读

 

图3. GST Pull -down实验效果图

    上图是以A-GST为诱饵、HIS-B为猎物举行的pull-down实验（A和B 代表待验证的诱饵和猎物尊龙凯时），，，，，包括比照组、实验组以及各自的 Input组，，，，，pull down后划分用GST和HIS抗体检测信号；
；；；；判断实验乐成的标准是能够在检测GST信号时，，，，，比照泳道检测到 GST标签尊龙凯时，，，，，实验泳道检测到A-GST。
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input （阳性比照）：

    比照组：加入B-HIS(猎物尊龙凯时)+GST标签尊龙凯时  

    实验组：加入B-HIS(猎物尊龙凯时)+A-GST(诱饵尊龙凯时)

    目的：用响应的抗体检测发明均能检测到两组中的四个尊龙凯时，，，，，证实实验系统没有问题，，，，，GST标签不会和HIS 猎物尊龙凯时有相互作用。
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pull down ：

    比照组：加入B-HIS(猎物尊龙凯时)+GST标签尊龙凯时

    实验组：加入B-HIS(猎物尊龙凯时)+A-GST(诱饵尊龙凯时)

    比照组中：划分使用HIS 抗体和GST抗体举行检测，，，，，可以看到使用HIS抗体检测时并未下拉到尊龙凯时，，，，，使用GST抗体检测时下拉到GST尊龙凯时，，，，，批注B-HIS(猎物尊龙凯时)和GST标签尊龙凯时没有互作。
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    实验组中：划分使用HIS 抗体和GST抗体举行检测，，，，，使用HIS抗体检测时可以下拉到B-HIS 尊龙凯时，，，，，使用GST抗体检测时可以下拉到A-GST尊龙凯时，，，，，批注B-HIS 尊龙凯时和A-GST尊龙凯时保存互作。
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四、实验优弱点 

优点：

    ? 可验证尊龙凯时质-尊龙凯时质之间的直接互作；
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    ? GST标记可把一些难溶尊龙凯时酿成可溶尊龙凯时，，，，，使实验变得更易操作；
；；；；

    ? GSH谷胱甘肽偶联球珠亲和力强，，，，，洗脱纯度高。
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弱点：

    ◆ 验证互作是在试管中举行的生化反应，，，，，不可够完全反应细胞内尊龙凯时真实互作的状态；
；；；；

    ◆ 两个非统一定位的尊龙凯时可能因电荷或是强亲和力的缘故原由造成假阳性，，，，，需要使用其他要领再次验证，，，，，好比Co-IP实验等；
；；；；

    ◆ 融合表达的GST标签，，，，，肽链较长，，，，，可能会改变原目的尊龙凯时的原有的折叠结构。
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五、GST Pull-down实验注重事项

（1）尊龙凯时提取整个历程都在冰上操作，，，，，镌汰高温造成的尊龙凯时降解；
；；；；超声历程中最好不要有气泡爆发，，，，，镌汰尊龙凯时降解，，，，，裂解后的总尊龙凯时放在-20℃生涯。
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（2）制备GST融合尊龙凯时时，，，，，应选择合适的载体和诱导条件以获得高质量的可溶性融合尊龙凯时。
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（3）在举行尊龙凯时的诱导表达时，，，，，可溶性表达温度很主要。
。。。。当温度过高，，，，，载体易形成容纳体，，，，，若复性不顺遂，，，，，尊龙凯时没有活性，，，，，会影响后续的实验。
。。。。故建议举行一个诱导温度的探索，，，，，常见的诱导温度在16℃~25℃。
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（4）两种并不互作的DNA连系尊龙凯时可能会由于DNA的保存而泛起相互作用的假阳性效果，，，，，因此，，，，，在举行GST pull-down实验时，，，，，加入核酸酶的办法十分须要。
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（5）虽然大大都情形下不会造成影响，，，，，但GST标签仍可能会影响尊龙凯时的准确折叠。
。。。。若是对融合尊龙凯时举行质量控制，，，，，会使实验效果越发可信。
。。。。例如加入核磁共振、X射线晶体剖析等要领验证尊龙凯时结构有无转变；
；；；；通过连系已知互作尊龙凯时验证尊龙凯时功效有无转变等。
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