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【干货】双荧光素酶实验老失败，，，，这些细节你get到了吗？？？？？？

信息泉源：金开瑞 作者：genecreate_cn 宣布时间：2025-01-06 14:39:00

    双荧光素酶实验是一种基于荧光素酶（Luciferase）的生物发光检测技术，，，，原理是使用荧光素酶与底物连系爆发化学发光反应的特点。。。该实验使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, F-Luc）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, R-Luc），，，，通过它们的活性来反应基因表达的转变和调控情形。。。

1、两种酶的作用是什么？？？？？？

    萤火虫荧光素酶可以催化荧光素氧化成oxyluciferin，，，，在荧光素氧化的历程中，，，，会发出生物荧光，，，，生物荧光可以通过酶标仪举行测定。。。萤火虫荧光素酶作为报告基因，，，，其表达水昭雪映了目的序列的活性。。。

    海肾荧光素酶可以催化腔肠素氧化成coelenteramide，，，，在腔肠素氧化的历程中，，，，会发出生物荧光，，，，生物荧光可以通过酶标仪举行测定。。。海肾荧光素酶作为内参基因，，，，可以扫除差别组之间细胞生长状态，，，，细胞数目以及转染效率带来的滋扰，，，，起到校正的作用，，，，从而使实验效果更可靠。。。

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2、两种酶的区别？？？？？？

    ?底物和辅因子差别：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时保存才华发光；；；；； ；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。。。 

    ?发光的颜色差别：萤火虫荧光素酶爆发的光颜色泛起黄绿色，，，，波长550-570nm；；；；； ；而海肾荧光素酶爆发蓝光，，，，波长480nm。。。正是由于这两种酶的底物和发光颜色差别，，，，以是在双荧光素酶报告实验中获得普遍应用。。。

 

3、实验流程

    双荧光素酶实验由于实验质料的差别可以分为动物双荧光实验和植物双荧光实验，，，，在基来源理上可能相似，，，，但在详细操作、实验目的和应用方面保存一些差别。。。

    ?动物双荧光实验：通过检测这两种光的荧光强度来反应实验条件下基因的表达情形。。。主要用于研究基因表达调控、信号转导途径等，，，，在药物筛选、疾病诊断和治疗等方面具有潜在应用。。。

    ?植物双荧光实验：同样基于荧光素酶的发光原理，，，，但可能涉及更重大的植物生物学历程，，，，如信号转导、基因表达和尊龙凯时质互作等。。。在植物育种、遗传改良、生物活性评估等方面具有普遍应用。。。

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4、适用于什么实验需要？？？？？？

（1）验证microRNA同mRNA靶向互作

    将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，，，，再共转入该microRNA，，，，检测荧光素酶活性下降，，，，则提醒为其靶序列。。。

（2）验证microRNA同lncRNA/circRNA靶向互作

    将待测lncRNA/circRNA序列插入报告基因载体，，，，再共转入该microRNA，，，，检测荧光素酶活性。。。

（3）验证转录因子与启动子互作

    将待测启动子序列插入报告基因载体中，，，，转录因子序列插入过表达载体，，，，再将启动子报告基因质粒+转录因子过表达质粒+内参质粒PRL-TK共转入细胞，，，，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，，，，启动转录越多，，，，那报告基因的表达量就越大，，，，荧光值越高。。。

（4）启动子结构剖析

    将启动子区域(约2k左右)举行分段截短或突变，，，，构建入报告基因载体，，，，检测荧光素酶活性。。。

（5）启动子SNP剖析

    一些基因的启动子区域保存单核苷酸多态性，，，，可运用荧光素酶报告系统剖析其相对活性。。。

 

5、实验乐成的要害点？？？？？？★★★★★

（1）实验质料准备：

    ♦合适的温度：室温下20-25℃举行操作，，，，实验前，，，，各个实验组分如：细胞裂解产品，，，，底物事情液等都需要恢复到室温。。。

    ♦实验因素生涯：萤火虫荧光素酶底物应按需分装，，，，阻止重复冻融，，，，并在-80℃避光生涯。。。海肾荧光素酶底物应现配现用，，，，以包管其活性。。。

    ♦细胞状态：选择活性较高、处于指数破碎期的细胞举行转染，，，，以提高转染效率和细胞存活率，，，，在举行转染之前，，，，需要作育相宜的宿主细胞至相宜的密度。。。

 

（2）实验操作历程

    ♦避光操作：整个实验操作历程应注重避光，，，，以避免荧光淬灭。。。

    ♦时间控制：实验历程应只管在30分钟内完成，，，，以包管效果的准确性。。。

    ♦样品混匀：包管裂解产品与底物快速混淆、混适时间一致，，，，阻止荧光素酶衰变的影响。。。

    ♦细胞裂解产品处置惩罚：细胞裂解产品常温不凌驾6小时；；；；； ；-20℃一个月；；；；； ；-80℃半年。。。

    ♦反应系统：双荧光素酶反应系统：20‌μl（细胞裂解产品）、100‌μl（萤火虫荧光素酶底物）、100‌μl（海肾荧光素酶底物），，，，底物量可凭证现真相形调解，，，，但一定要包管底物过量，，，，不然会造成检测效果泛起大的误差。。。

（3）实验设计及效果剖析

    ♦设立比照和重复：实验中应设立阳性和阴性比照，，，，以验证实验系统的有用性且需要做3个或3个以上复孔，，，，并且引入另一个报告基因作为内参，，，，主要是同批次样品检测值也可能泛起浮动，，，，扫除多种滋扰因素的影响（细胞状态、转染效率、载体质量、裂解速率、加样精准度等）。。。

    ♦荧光值控制：荧光值过高可能会凌驾仪器的检测规模，，，，导致无法检测到值，，，，一样平常建议将荧光值控制在5-6位之间。。。若是荧光值过高，，，，可以通过镌汰转染质粒量或适当稀释细胞裂解离心后的上清液来调解。。。若是荧光值过低或无荧光值，，，，应从转染效率、启动子活性等方面举行排查。。。

    ♦检测效果：检测前应检测孔板或空管的发光值，，，，作为仪器发光配景值，，，，样品检测发光值应该远大于仪器配景值。。。若是样品发光值过于靠近仪器配景值，，，，说明样品中荧光素酶过少，，，，需要思量转染量、转化或转染效率、裂解效率等因素。。。

 

6、双荧光素酶实验有哪些优点？？？？？？

    ?迅速度高：比Western blot迅速度高1000倍以上，，，，优于GFP定量剖析；；；；； ；

    ?无报告基因：报告基因泉源于萤火虫，，，，较为特异。。。植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达；；；；； ；

    ?不受物质影响：荧光素酶检测不受细胞内其它物质影响；；；；； ；

    ?检测利便/规模广：检测规模广，，，，大于7个数目级；；；；； ；

 

7、金开瑞交付内容及实验效果展示

 

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    双荧光素酶实验在生命科学研究中施展着主要的作用，，，，为解决更多生物学难题提供了强有力的技术支持。。。我司能够提供包括双荧光素酶实验、荧光素酶尊龙凯时互补实验（LCA）、双分子荧光互补（BIFC）等技术效劳，，，，从计划流程设计到技术试验执行，，，，从科研技术效劳到制品试剂盒提供，，，，金开瑞实验平台知足您的一切需求，，，，期待与您一起携手相助。。。

 

常见问题与解答

 

Q、怎样判断双荧光素酶实验系统无异常，，，，获得客观的实验效果？？？？？？

可以从以下几个方面来考察实验效果的客观性：

(1) 比照的2个实验组，，，，即实验组1与实验组2 luc表达情形应无显著差别；；；；； ；

(2) 转染正常，，，，质�；；；；； ；騧imic确保乐成转染入细胞；；；；； ；

(3) luc检测值在仪器检测线性规模内。。。

 

Q、海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比，，，，相对活性怎样？？？？？？

    在氧、镁和ATP的保存下，，，，萤火虫荧光素酶作用于萤火虫荧光素，，，，而泉源于海洋腔肠（Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的保存下作用于海肾荧光素。。。双报告基因技术（Dual-reporter assays），，，，连系了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。。。

 

Q、在金开瑞做荧光素酶报告基因检测，，，，需要提供什么？？？？？？实验效果包括哪些？？？？？？

您需要提供：

（1）基因序列，，，，需提供详细的转录因子、目的基因或microRNA信息；；；；； ；

（2）实验细胞，，，，如无特殊要求，，，，金开瑞默以为使用293T细胞，，，，则无需提供。。。实验竣事后，，，，金开瑞会为您提供实验流程及完整报告一份，，，，包括实验原始数据、图片、剖析效果等。。。

 

Q、荧光素酶作为报告基因相比于荧光尊龙凯时有哪些优势？？？？？？

    Luciferase的迅速度相比于GFP提高10-100倍以上，，，，同时具有更宽的动态规模，，，，便于数值剖析较量，，，，不需要荧鲜明微镜，，，，并且在活体实验中其荧光穿透性高于EGFP等荧光尊龙凯时，，，，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。。。

    而GFP等荧光尊龙凯时相比于荧光素酶的优势在于可以举行失踪定位，，，，并且其视察不需裂解细胞，，，，利便举行适时视察。。。

 

Q、双荧光素酶报告基因的载体比例?

    凭证实验详细情形调解。。。建议作一个预实验来调解（萤火虫载体与海肾载体比例划分用1：10、1：20、1：50、1：100），，，，萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。。。

 

Q、双荧光素酶报告基因检测效果是什么？？？？？？

(1)检测前应检测孔板或空管的发光值，，，，作为仪器发光配景值，，，，Modulus多功效检测仪的仪器配景值应小于100；；；；； ；

(2)样品检测发光值应该远大于仪器配景值，，，，例如10000。。。若是样品发光值过于靠近仪器配景值，，，，说明样品中荧光素酶过少，，，，需要思量转染量、转染效率、裂解效率等因素。。。

 

Q、双荧光素酶实验效果荧光值过高?

    荧光值过高可能会凌驾仪器检测规模，，，，从而检测不到值，，，，一样平常读数在5-6位之间较好。。。荧光值过高可通过以下方法实验解决：镌汰质粒转染量，，，，细胞样品裂解后，，，，离心取上清后检测或对裂解产品举行稀释后检测。。。不建议通过镌汰底物量来降低荧光值，，，，需要包管底物的饱和来反应荧光素酶真实的表达水平，，，，不然会造成检测效果泛起大的误差。。。

 

Q、双荧光素酶报告基因实验效果荧光值过低或无荧光值?

(1)启动子活性低：a.优化细胞的作育条件，，，，提高荧光素酶的表达量；；；；； ；b.替换强启动子（如SV40、CMV）。。。

(2)转染效率低：a.优化转染实验条件，，，，用较易转染的质粒做阳性比照（如转染过表达荧光尊龙凯时质粒）；；；；； ；b.确保转染DNA的质量，，，，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的要领对DNA质量举行判断；；；；； ；c.选择活性较高，，，，处于指数破碎期的细胞举行转染。。。

(3) 样品裂解效率低a.细胞作育时间不宜过长，，，，12-36h内最好，，，，长时间作育后，，，，细胞可能会难裂解；；；；； ；b.加入的裂解液需足量，，，，包管细胞能够充分裂解。。。

(4)检测历程操作不规范a. 选择合适的检测仪器，，，，如Luminometer 发光计、多功效酶标仪或者其他能够检测生物发光的仪器都适用于该实验；；；；； ；b.需加入足量底物，，，，包管底物的饱和，，，，不然会造成检测效果泛起很大误差；；；；； ；c.室温反应。。。酶促反应对温度较为敏感，，，，反应时各个组分（细胞裂解产品，，，，底物事情液等）都需要调解到室温（20-25℃）再使用；；；；； ；d.荧光素酶的半衰期一样平常约30min，，，，加完底物后可立即检测，，，，只管在30min内完成；；；；； ；e. 检测板：为避免孔间滋扰，，，，推荐使用不透光白色酶标板。。。玄色酶标板也可用，，，，但因玄色会吸收光信号，，，，可能会降低信号。。。

(5) 底物氧化失效a.底物避光密封生涯，，，，萤火虫荧光素酶底物-20℃生涯；；；；； ；海肾荧光素酶底物推荐-80℃生涯；；；；； ；b. 反应事情液建议现用现配。。。




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