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科研人必需掌握构建载体的要领：超详细载体构建计划

信息泉源：金开瑞 作者：genecreate_cn 宣布时间：2025-01-25 10:46:00

一、什么是载体构建？？？？？

    DNA需以质粒的形式才华稳固保存，，，那怎样将DNA分子运送到受体细胞中去呢？？？？？这个时间我们就需要思量能不可使用一种载体，，，既可以将其运送到受体细胞，，，又可以让其稳固保存。。。

    实现这个想法就需要用到载体构建：将目的片断插入到线性化的载体骨架上，，，在酶的作用下，，，片断和骨架重新形成一个环形的质粒，，，再导入宿主细胞，，，实现目的基因在宿主细胞内的准确表达。。。

载体特点：

    可自我复制：复制子 ori是一段具有特殊结构的DNA序列；；；

    标记基因：有一个或多个便于检测的遗传表型，，，如抗药性、显色表型反应等；；；

    酶切位点：有一个或几个限制性内切酶位点，，，便于外源基因片断的插入；；；

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图1.载体构建原理
 

二、载体构建计划

1 、引物设计

♦ 可以使用NCBI的一个在线工具：

Primer-Blast网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

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图2.Primer-Blast网站设计引物说明图

♦ 设计引物遵照规则

    1、18-25bp长，，，引物GC含量40-60%；；；

    2、引物Tm值58-65度，，，正反向引物相差小于4度,Tm=4℃(G + C)+ 2℃(A + T)；；；

    3、3’端最后5个碱基中的G或C少于2个，，，3端不要两个一连的G或C，，，引物3’端泛起3个以上的一连碱基，，，如GGG 或CCC，，，也会使过失引发机率增添；；；

    4、两引物间3端末相互配对小于2个碱基，，，一条引物内部5端和3端配对小于3个碱基，，，以免引物二聚体，，，一对引物间不应多于4个一连碱基的同源性或互补性；；；

    5、3端最好不要T最后，，，末位碱基为A 的错配效率显着高于其他3 个碱基，，，因此应当阻止在引物的3’端使用碱基A，，，最好选择C或G；；；

    6、引物内部4种碱基匀称漫衍，，，不要嘌呤（A、G）或嘧啶（T、C）一连保存，，，C、G或A、T不要太过集中，，，特殊3端；；；

    7、引物不要有发夹结构，，，引物自身一连互补碱基不可大于3bp（判断标准）；；； 

    8、引物3′端不要终止于密码子的第3位。。。

 

2 、目的基因获得

（1）PCR扩增

    设计引物：在扩增目的片断所用的正反引物中划分引入差别的两个酶切位点序列，，，而载体上也有这两个酶切位点（以EcoRI和KpnI为例）；；；PCR扩增后用1%琼脂糖凝胶接纳目的基因DNA条带，，，若是PCR条带很是简单，，，PCR效果特异性高，，，可不经凝胶电泳直接接纳PCR产品

（2）在已有载体上截取（用响应的内切酶直接切下，，，电泳后接纳）

（3）人工合成

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3 、目的片断和质粒的双酶切

    限制性内切酶能特异地连系于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其周围的特异位点上，，，并切割双链DNA。。。

    T4 DNA毗连酶可选择性的将相同的黏性最后毗连起来，，，从而确保目的片断以准确的偏向接入载体。。。

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图3. 载体酶切和毗连示意图

    对载体及目的片断举行双酶切，，，用EcoRI和KpnI对证粒载体PUC57和目的基因PCR产品举行双酶切，，，酶切反应反应系统如下表所示（总系统 50 μL）：

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    酶切系统配备好以后，，，37 ℃ 水浴！�。ń鹗粼』� PCR 仪均可）2 h，，，关于双酶切后的载体和目的片断，，，需要跑胶后确认片断巨细是否准确，，，将酶切好的条带切下举行胶接纳即可（琼脂糖凝胶DNA接纳试剂盒）。。。

    注重：一样平常胶接纳试剂盒接纳率50%左右，，，若是DNA分子量大于10K后接纳效率就更低，，，注重控制酶切系统中的DNA的量，，，量大酶切容易切不彻底，，，量少接纳后浓度过低。。。

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图4. 载体和目的基因双酶切胶图

 4、毗连转化

    ♦ 毗连：质粒PUC57 EcoRI+KpnI酶切接纳大片断与目的基因毗连，，，在0.2 mL 微量离心管中制备毗连反应液：1 µL 10×T4 DNA Ligase Buffer，，，约0.2 pmol 目的片断，，，约0.02 pmol 的载体骨架，，，0.5 µL T4 DNA Ligase，，，ddH2O up to10 µL，，，毗连反应在16℃反应12小时。。。

    ♦ 转化：取10 µL毗连产品与100µL DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，，，42℃热激90s，，，立即置冰上安排5min，，，加入预热至室温的700µL LB作育基，，，37℃恒温摇床作育50min，，，吸收 200µL的菌液，，，用移液器混匀后匀称涂布于含100µg/mL Amp抗性(凭证实验要求选择抗生素)的LB平板上，，，37℃恒温作育箱倒置作育住宿。。。

    注：目的片断的摩尔数应控制在载体摩尔数的3-10倍；；；摩尔数与质量：1 µg 1,000 bp DNA=1.52 pmol，，，1 µg pUC57 DNA（2,720 bp）=0.57 pmol。。。

 

5、挑取克隆提质粒验证

    挑取5个单菌落接种于含5ml，，，100μg/mL Amp抗性的LB作育液中，，，300rpm，，，37℃恒温摇床作育住宿，，，对住宿的菌液举行扩增，，，选择阳性菌液，，，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，，，再举行测序验证。。。

 

三、失败履历总结

    ♦ XbaI位点后面带TC：设计引物及选择酶切位点时注重阻止。。。选择去甲基化的菌种如JM110，，，然后重新制备质。。。

    ♦ 紫外太过损伤粘性最后：使统一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体，，，其中最容易形成的是TT二聚体导致DNA受到破损。。。

    ♦ 片断加入越多越好？？？？？DNA加入过多，，，酶反应不完全。。。反应时间时间过长，，，酶的特异性降低。。。

    ♦ 质料试剂的生涯与历程纪录：实验纪录和数据一定生涯纪录好，，，不然“一夜回到解放前”，，，纯纯白干喽！




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