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干货分享 | 怎样快速高效的设计siRNA？？？？？？

信息泉源：金开瑞 作者：genecreate_cn 宣布时间：2025-01-15 15:24:30

    siRNA小滋扰核糖核酸（small interfering RNA）指一类长约21-23nt的双链RNA分子，，，，一样平常3’端有两个游离的碱基，，，，5’端有磷酸基团的双链RNA，，，，其主要功效是与对应的mRNA连系后促使mRNA爆发降解，，，，镌汰对应尊龙凯时的表达，，，，进而抵达基因默然的效果。。。。。使用siRNA举行基因默然因实验操作利便，，，，深受众多科研事情者青睐，，，，也成为了分子生物学应用中最常用的基因下调工具。。。。。

    siRNA序列的获�。。。。。�，，，可以接纳以下要领：（核对种属很要害�。。。。。。。。。。�）

    ?首选要领应该是“文献法“，，，，从文献中获取siRNA序列，，，，文献中已经做过验证了，，，，自己做出来可能性更大

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    若是小同伴们想自己下手设计引物，，，，小金也给各人准备了超等详细的siRNA引物设计规则和流程，，，，接下来一起随着小金来学习吧。。。。。

 

一、siRNA引物设计基来源则

1. siRNA靶向位置

    ♦靶点通常选择目的基因的CDS（编码序列）区，，，，由于这里的序列在生物体内相对稳固且易于展望。。。。。一样平常来说，，，，从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸最先征采理想的siRNA序列，，，，越靠近靶基因的3′端，，，，其基因默然效果可能越好。。。。。

    ♦使用NCBI的BLAST工具对设计的siRNA序枚举行比对，，，，确保其特异性。。。。。比对时，，，，可以选择nucleotide to nucleotide模式，，，，数据库选择Genomic+transcript databases。。。。。BLAST效果中，，，，siRNA靶向其他基因的错配数越大，，，，特异性越好。。。。。

    ♦思量选择多个靶标，，，，并对每个靶标设计2~4条siRNA序列以增添默然效率。。。。。

2. siRNA序列的起始碱基与长度

    一样平常来说，，，，siRNA序列长度在19～29 nt之间，，，，序列过长（如凌驾30nt）可能导致与其他mRNA非特异性连系的概率增大。。。。。研究批注，，，，27 nt或29 nt的siRNA与21 nt siRNA相比，，，，27 nt siRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下获得，，，，（不过照旧应该详细问题详细剖析，，，，在设计引物的时间，，，，思量多种因素，，，，多设计几对）。。。。。

3. siRNA 3′端突出碱基的选择

    一样平常情形下，，，，3′端的2 个碱基使用突出的dTdT（deoxythymidine dinucleotide）取代，，，，能够增强siRNA 双链复合体的稳固性，，，，进而增添siRNA的敲低效率，，，，通常情形下，，，，公司合成序列时会自动增添dTdT结构。。。。。

4. GC含量

    GC（鸟嘌呤和胞嘧啶）含量应控制在30%~55%之间，，，，也有说法以为理想的GC含量规模是35%~52%或35%~55%，，，，适当的GC含量有助于坚持siRNA双链的稳固性，，，，同时提高基因默然效率。。。。。

5. siRNA 序列应阻止一连碱基和反向重复序列

    siRNA序列中一连2个及以上G/C够降低双链RNA内在稳固性，，，，从而降低siRNA在细胞中的敲低效率；；；一连3个以上的A和U可能终止由RNA Polymerase III介导的转录作用。。。。。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，，，，这种结构的保存可以降低siRNA默然效率。。。。。

6. siRNA双链的内在稳固性

    一样平常情形下，，，，siRNA的稳固性直接影响其最终在细胞中的敲低效率。。。。。在siRNA的反义链5’端第一个碱基只管可能是为A或U; siRNA正义链的5’端第一个碱基只管为G或C。。。。。

7.序列特异性

    ♦应阻止一连的简单碱基（如一连4个以上的A或T）和反向重复序列，，，，这些序列可能降低双链RNA的内在稳固性。。。。。

    ♦siRNA序列中不应泛起与目的基因以外的其他基因高度相似的序列，，，，以镌汰脱靶效应。。。。。

    ♦现在没有研究报道siRNA的滋扰效率与mRNA中详细位置的关系，，，，因此，，，，在设计siRNA时间应思量多条siRNA，，，，siRNA对应到靶基因的差别位置或在靠近3′端多设计一条，，，，差别序列之间距离应该在25-30bp之上。。。。。

8. siRNA正义链的碱基偏幸性

     正义链的第一位和第十九位碱基为A;正义链的第十位碱基为U;正义链的第十三位碱基不为G;正义链的第十九位碱基不为G或C时，，，，siRNA 序列具有较高的基因默然效率

9.其它注重事项

    siRNA的3’最后突出碱基通常选择UU，，，，其基因抑制效率最高，，，，可是3’端应阻止GG结构，，，，由于RNase会降解以G为末尾的RNA单链。。。。。
 

二、siRNA引物设计办法 

    siRNA 有许多在线设计网站，，，，接下来以两个经典网站为例，，，，给各人详细介绍怎样设计siRNA引物？？？？？？

    siDirect 设计网站：http://sidirect2.rnai.jp

    DSIR 设计网站：http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html

1、NCBI网站获得基因的Accession Number
 

    NCBI网址: https://ww.ncbi.nlm.nih.gov/

（1）在NCBI官网上搜索选项选择【Nucleotide】-搜索框输入【基因+物种+mRNA】-点击搜索。。。。。

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（2）如下图中所示，，，，确认物种信息，，，，发明是我们要找的P53基因，，，，然后我们点击进入到详细页面


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（3）选择FASTA序列名堂

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（4）复制整个基因GenBank: AB082923.1序列，，，，可以新建一个tex文档生涯。。。。。

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2、使用siDirect 网站设计siRNA引物

（1）输入基因序列：翻开网址：http://sidirect2.rnai.jp，，，，进入网站后，，，，输入NCBI 上的GenBank编号：AB082923.1，，，，复制FASTA序列填入，，，，可以直接点击design siRNA ，，，，也可以先选择下方的options 举行参数设置。。。。。

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（2）options参数设置：可以凭证小我私家需要设置 Target range，，，，由于GC含量在30%-52%的siRNA 序列，，，，基因默然效果好，，，，以是可以将GC含量控制在这个规模，，，，填写好参数以后，，，，可以点击design siRNA ，，，，举行引物设计。。。。。

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（3）筛选siRNA引物：凭证我们上面列出的siRNA引物设计原则选择3对最佳的引物序列，，，，复制响应的引物序列整理成表，，，，交给公司合成引物。。。。。

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3、使用DSIR 设计网站设计siRNA引物

（1）输入网址：http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html，，，，进入网站后输入基因名称，，，，复制基因序列填入框内或者选择生涯的tex 文件夹上传该序列。。。。。接下来，，，，设置响应的参数，，，，选择siRNA引物的长度，，，，阻止爆发免疫刺激基序这一栏选择：Yes, 网站会针对设计的引物举行评分，，，，评分越高意味着默然效果会更好。。。。。

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（2）选择排名靠前的siRNA引物，，，，分数越高，，，，排名越靠前，，，，默然效果越好。。。。。

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    在获得想要的引物序列后，，，，就可以发给公司了举行合成了。。。。。金开瑞配备了种种规格的全自动合成仪，，，，先进的纯化装备，，，，并拥有富厚的RNA合成履历，，，，已经完善了一整套RNA合成及纯化技术，，，，能够提供高质量的RNA合成产品。。。。。

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