siRNA（小滋扰RNA，，，Small interfering RNA）转染实验是现代分子生物学研究中的一项主要技术，，，它基于RNA滋扰（RNA interference, RNAi）原理，，，通过导入特定的siRNA分子来靶向并默然特定的基因表达。。。。。这一技术不但为基因功效研究提供了强有力的工具，，，还在疾病治疗、药物筛选及遗传性疾病治疗等领域展现出辽阔的应用远景。。。。。

 

一、RNA滋扰机制

    RNA滋扰是一种普遍保存于生物体内的序列特异性基因转录后默然历程。。。。。当siRNA进入细胞后，，，它们会被胞质中的核酸内切酶Dicer进一步裂解成更小的片断，，，随后与体内尊龙凯时连系形成RNA诱导的默然复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。。。。。RISC具有切割mRNA的能力，，，它能够在siRNA的指导下，，，特异性地识别并切割靶基因的mRNA，，，从而阻断该基因的表达。。。。。这一历程被称为转录后基因默然机制。。。。。

RNAi机制示意图 （Jain R G., et al. Insects, 2020.）

    虽然siRNA药物在疾病治疗方面显示出重大的潜力，，，但由于缺乏有用的药物递送要领，，，其在临床情形中的使用受到很大的限制，，，而siRNA转染是RNAi技术应用的瓶颈，，，以是siRNA转染效果是在细胞水平验证基因功效或举行基因默然实验乐成的要害历程。。。。。

 

二、怎样实现siRNA高效转染

实现siRNA的高效转染，，，需要关注以下几个方面？？？？？？

 01.细胞准备

    细胞状态：选专心理状态优异的细胞举行转染，，，康健的细胞转染效率较高。。。。。

    细胞密度：在转染前一天接种细胞，，，确保细胞密度在第二天转染时抵达70%~80%（差别转染试剂对密度要求纷歧样）。。。。。铺板时要将细胞消化完全并匀称铺板，，，阻止细胞群集生长。。。。。

 

 02.转染试剂与siRNA的配制

    siRNA纯化：为了提高转染效率，，，siRNA的浓度和纯度很是主要，，，推荐使用PAGE胶纯化等要领获得高纯度的siRNA。。。。。

    阻止RNA酶污染：由于RNA酶普遍保存于实验情形中，，，因此应确保实验中的每个环节不受RNA酶污染，，，以包管siRNA的完整性。。。。。

    转染试剂选择：针对siRNA制备要领以及靶细胞类型的差别，，，选择合适的转染试剂。。。。。常用的转染试剂如Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000和RNAiMAX等，，，具有差别的转染效率和细胞毒性，，，应凭证实验需求举行选择。。。。。好比：Lipofectamine 3000适用于种种难以转染的以及常见的细胞类型，，，对细胞作用温顺，，，毒性低，，，适用于DNA、RNA和共转染。。。。。Lipofectamine RNeasy Max转染试剂：主要供siRNA和Stealth RNeasy双链体转染使用，，，具有转染效率高、对细胞毒性小等优点。。。。。

    转染试剂配制：siRNA和转染试剂应划分用无血清无双抗的作育基（如Opti-MEM）举行稀释，，，并混淆形成转染复合物。。。。。在配制历程中，，，应阻止粗暴操作，，，以免导致脂质体失效。。。。。

 

 03.转染操作

    转染前换液：在转染前替换细胞作育基为无血清无双抗的作育基。。。。。

    加入转染复合物：将配制好的转染复合物轻轻加入细胞作育板中，，，并轻轻摇晃使之混淆匀称。。。。。

    转染后换液：由于助转染试剂具有一定细胞毒性，，，需要在转染后4~8小时内实时换液，，，将无血清作育基替换为完全作育基。。。。。但需注重，，，差别转染试剂的换液时间可能有所差别，，，应凭证试剂说明书和实验履历举行调解。。。。。

 

 04.转染效率验证与优化

    设置比照：为了客观地判断RNA滋扰的效果，，，实验时必需设置阴性比照。。。。。通常的做法是把siRNA序列顺序打乱，，，重新排列，，，作为阴性比照；；；；也可以选择背面任何基因匹配的无关序列作为比照。。。。。

    荧光标记：使用荧光标记的siRNA可以剖析siRNA的稳固性和转染效率。。。。。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验来追踪转染历程中导入了siRNA的细胞。。。。。

    优化条件：通过实验找到最佳转染条件，，，包括脂质体与siRNA的比例、细胞密度、转染时间和作育基中血清的含量等。。。。。别的，，，还可以实验差别的转染试剂浓度和体积来优化转染效率。。。。。

 

 05.转染流程

    下列办法以24孔板为例，，，所有试剂用量和体积均是按每孔盘算。。。。。

    贴壁细胞：转染前一日，，，每孔0.5-2.0×10⁵个细胞接种于500µL含抗生素的作育基中，，，转染时细胞长至70%融合最佳。。。。。

（1）转染复合物的制备

    a）稀释转染试剂：使用前，，，将转染试剂安排于室温中，，，轻轻混匀，，，然后在无菌管中加入50µL无血清作育基或OPTI-MEM，，，再加入2µL转染试剂，，，用移液器轻轻混匀，，，室温静置5min；；；；

    b）稀释siRNA：在另一无菌管中加入50µL无血清作育基或OPTI-MEM，，，并添加2µL siRNA，，，用移液器轻轻混匀，，，室温静置5min；；；；

    c）将转染试剂/作育基混淆物滴加至siRNA作育基混淆物中，，，用移液器轻轻混匀，，，室温静置15~20min。。。。。

    注：稀释好的转染试剂若是长时间安排可能导致转染试剂活性的降低，，，应只管30min之内与稀释好的 siRNA 混和。。。。。

（2）转染历程

    a）趁静置时，，，给24孔板换液，，，每孔换上400µL预热的新鲜作育基；；；；

    b）将 100µL转染复合物加入孔中，，，终系统为500µL，，，加完后将板轻轻晃动以使复合物匀称漫衍；；；；

    c）37℃静置作育细胞，，，4 -6h换成完全作育基。。。。。24-72 h检测mRNA表达，，，48-96 h检测尊龙凯时表达。。。。。

 

作育板	作育孔面积	接种作育液	稀释用作育基	siRNA转染
				siRNA	转染试剂
96孔板	0.3 cm²	100µL	2×10µL	20 pmol	1µL
24孔板	2.0 cm²	500µL	2×50µL	40 pmol	2µL
12孔板	4.0 cm²	1mL	2×100µL	80 pmol	4µL
6孔板	10.0 cm²	2mL	2×200µL	150 pmol	7.5µL
60mm	20.0 cm²	5mL	2×0.5mL	300 pmol	15µL
10cm	60.0 cm²	15mL	2×1mL	600 pmol	30µL

注：该要领仅供参考，，，详细操作流程应以转染试剂说明书为准。。。。。

 

三、siRNA默然效果的评估要领

    siRNA 转染细胞后，，，会诱发宿主细胞中的mRNA爆发降解，，， 从而抑制了细胞内目的基因尊龙凯时的表达，，，我们可以从三个方面最先验证siRNA实验转染效果。。。。。

◆mRNA水平检测

    siRNA的作用机理在于其引起靶基因mRNA的降解，，，通过检测mRNA的降解水平可以验证siRNA的默然效率。。。。。通常，，，在转染后24~48小时收样，，，提取细胞总RNA提取，，，合成cDNA全长，，，用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等要领检测举行检测。。。。。由于细胞种类、作用基因表达情形的差别，，，各实验最佳检测时间也不相同，，，检测时间过晚可能导致检测不到滋扰效果。。。。。

◆尊龙凯时水平检测

    siRNA滋扰也会影响靶尊龙凯时的表达，，，可以通过Western blot等要领检测靶基因尊龙凯时的表达水平，，，可以进一步验证siRNA的默然效果。。。。。通常，，，在转染后48~72小时收样举行检测，，，（由于尊龙凯时表达受到影响因素较多，，，如检测尊龙凯时水平转变不显着请检测其mRNA水平转变情形，，，确定siRNA是否起作用）。。。。。

◆细胞表型视察

    视察转染后细胞的表型转变（如细胞增殖、凋亡、迁徙等），，，可以间接评估siRNA的默然效果，，，这种要领需要连系详细的实验目的和细胞类型举行剖析。。。。。

图源：https://www.gene-quantification.de/si-rna-index.html

 

四、注重事项

◆转染常见注重事项

    1、无论您用什么转染试剂，，，转染时只管不要加血清，，，血清内里的小分子会与siRNA竞争性进入细胞，，，会影响转染效率，，，也有说血清里含有RNA酶，，，会将siRNA给降解掉。。。。。

    2、转染后一样平常推荐8-12h换液，，，这时可以加血清与正常作育细胞一样。。。。。

    3、转染前应凭证细胞种类、生长速率等因素决议转染时的细胞密度。。。。。推荐细胞密度在60%-80%时举行转染实验，，，细胞密度过低将影响检测效果。。。。。siRNA会随着细胞增殖降低在细胞内的浓度。。。。。例如：转染时细胞密度50%，，，转染效率抵达100%，，，siRNA的有用率也100%，，，36h后细胞长满平皿举行检测，，，最后提的总RNA默然效率可能只有50-60%。。。。。细胞密度过大，，，如凌驾90%，，，也会影响转染效率且后期细胞会由于密度过大生长情形受到影响无法获得理想实验效果。。。。。

◆转染后实验效果检测注重事项

    1、siRNA进入细胞后还要举行解链，，，反义链寻找连系位点，，，经由酶剪切再将目的RNA降解。。。。。建议转染完换液后24-36h提总RNA，，，做qRT-PCR检测，，，48-72h提尊龙凯时做WB检测。。。。。通俗的siRNA进入细胞后能维持默然效果或许1-3天。。。。。加化学修饰的siRNA能维持2-5天。。。。。

    2、由于RNAi实验是直接作用与mRNA的，，，以是我们只能包管mRNA水平有用，，，不可包管尊龙凯时水平有用。。。。。我们遇到过mRNA水平下调，，，尊龙凯时水平没有转变的例子。。。。。

    3、目的基因ΔCt与管家基因如GAPDHΔCt值相差在15以内才适合做RNAi实验。。。。。如基因自己表达量很低，，，效果往往不会太理想。。。。。

    4、正常实验组应该有①空缺组（什么都不加的）；；；；②只加转染试剂的组；；；；③NC组；；；；④siRNA组；；；；⑤阳性比照组。。。。。理想的效果是①②③组的数据应该相同，，，或者差别不大。。。。。

    a）若是NC组与空缺组比下调凌驾50%说明NC起作用了，，，说明NC毒性大。。。。。这时应该降低siRNA和NC的用量。。。。。降低用量后，，，下调照旧显着，，，就要换一个NC试一试。。。。。

    b）若是②与①比下调显着，，，说明转染试剂毒性太大，，，需要替换转染试剂。。。。。

    5、我们推荐 RT-PCR 的引物应该设计在 target 位置的两侧，，，而不是同侧。。。。。现在已经知道的 siRNA 介导的基因 knockdown 机制是 RSIC 先介导靶 mRNA 的切割，，，切割导致靶 mRNA 的降解，，，由于切割和降解可能具有差别的时间点，，，因此，，，设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性效果或 knockdown 效率的低估。。。。。另外，，，RT-PCR 效果会由于靶基因 mRNA 降解时间差别、细胞内靶基因 mRNA 品貌差别而导致假阴性效果，，，特殊关于品貌较高的基因，，，推荐使用的检测方法包括PCR、Northern 检测、Western 检测等。。。。。这些要体会越发真实的反应 RNAi 的效果。。。。。